洛阳地区种嗜尸性丽蝇和基因序列分析 - 洛阳师范学院学报杂志社投稿

来稿应自觉遵守国家有关著作权法律法规，不得侵犯他人版权或其他权利，如果出现问题作者文责自负，而且本刊将依法追究侵权行为给本刊造成的损失责任。本刊对录用稿有修改、删节权。经本刊通知进行修改的稿件或被采用的稿件，作者必须保证本刊的独立发表权。一、投稿方式： 1、请从我刊官网直接投稿。 2、请从我编辑部编辑的推广链接进入我刊投审稿系统进行投稿。二、稿件著作权： 1、投稿人保证其向我刊所投之作品是其本人或与他人合作创作之成果，或对所投作品拥有合法的著作权，无第三人对其作品提出可成立之权利主张。 2、投稿人保证向我刊所投之稿件，尚未在任何媒体上发表。 3、投稿人保证其作品不含有违反宪法、法律及损害社会公共利益之内容。 4、投稿人向我刊所投之作品不得同时向第三方投送，即不允许一稿多投。 5、投稿人授予我刊享有作品专有使用权的方式包括但不限于：通过网络向公众传播、复制、摘编、表演、播放、展览、发行、摄制电影、电视、录像制品、录制录音制品、制作数字化制品、改编、翻译、注释、编辑，以及出版、许可其他媒体、网站及单位转载、摘编、播放、录制、翻译、注释、编辑、改编、摄制。 6、第5条所述之网络是指通过我刊官网。 7、投稿人委托我刊声明，未经我方许可，任何网站、媒体、组织不得转载、摘编其作品。

洛阳地区种嗜尸性丽蝇和基因序列分析

作者:

关键词:

摘要：

采用法医昆虫学（forensic entomology）的方法进行死亡时间（postmortem interval，PMI）推断有重要意义[1]。机体死后不同阶段，到达尸体上的嗜尸性昆虫种类不同，呈现较强的演替规律。丽蝇往往是第一批到达尸体并产卵的嗜尸性昆虫，但丽蝇种类繁多，需要积累更多的基因资源来进行鉴定研究。本研究通过细胞核28S核糖体核糖核酸（ribosomalribonucleic acid，rRNA）和线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因对洛阳地区常见嗜尸性丽蝇进行分子鉴定，以期作为形态学鉴定的重要方法补充，并完善嗜尸性丽蝇的鉴定系统。

1 材料与方法

1.1 蝇类样本采集

于2016年6月—2017年5月，诱捕采集放置于河南科技大学（洛阳）室外树荫下大鼠尸体上的嗜尸性丽蝇。共捕捉到3只丝光绿蝇Lucilia sericata（Meigen，1826）、3 只大头金蝇Chrysomya megacephala（Fabricius，1794）、2 只铜绿蝇Lucilia cuprina（Wiedemann，1830）、2 只叉丽蝇Triceratopyga calliphoroides（Rohdendorf，1931）、3 只反吐丽蝇Calliphora vomitoria（Linnaeus，1758）、3只巨尾阿丽蝇Aldrichina grahami（Aldrich，1930）、1只叉叶绿蝇Lucilia caesar（Linnaeus，1758）、3只亮绿蝇Lucilia illustris（Meigen，1826）、3只紫绿蝇Lucilia porphyrina（Walker，1856）。微量离心管分类单独密封包装后置于-20℃冰箱中保存。依据《中国常见蝇类检索表》进行形态学种类鉴定，并经专家再次确认。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

每个样本取腿4条，清洗、捣碎，用MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（日本TaKaRa公司）提取腿部DNA，置于-20℃保存备用。剩余样本组织装回原微量离心管，冷冻保存。

1.2.2 PCR扩增

采用Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye）试剂盒（日本TaKaRa公司）对28S rRNA基因中的目的片段和COⅠ基因经典DNA条形码引物（LCO1490/HCO2198）进行扩增。28S rRNA基因的扩增引物为：上游引物5′-GACTACCCCCTGAATTT AAGCAT-3′，下游引物 5′-GACTCCTTGGTCCGTGT TTCAAG-3′。

扩增总体系为 50 μL，内含 2×Premix Taq溶液（含DNA聚合酶、缓冲液、dNTP混合液）25μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板6 μL，ddH2O补足。PCR循环参数：94℃预变性1 min；94℃ 1 min，45℃ 1.5 min，72℃ 1.5 min，5个循环；94℃ 1 min，50℃ 1.5 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸8min。扩增产物于4℃保存。

1.2.3 电泳检测及测序分析

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳（120V，30min），溴化乙锭染色，置于凝胶成像系统拍照分析。

测序引物为PCR扩增引物，扩增产物由英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，正反向双向测序以保证序列的准确性。应用MEGA 7.0软件将所测23个样本的基因序列进行整理，在BLAST搜索（ 7.0软件比对，剪切为相同长度，然后按邻近法（neighbor-joining，NJ）对序列进行碱基组成、进化分歧率和系统发育树分析（以家蝇为外群），Bootstrap值为1000。

2 结果

本研究共获得5属9种23个丽蝇样本的DNA，扩增产物使用分析软件剪去引物和杂带后，余下序列长度分别为715bp和637bp。

2.1 BLAST比对结果

28S rRNA和COⅠ基因序列的BLAST比对结果（表1～2）显示，所得样本DNA与GenBank中已知序列相似度较高（≥99%），与形态学鉴定结果相符，但28S rRNA序列比对结果中没有一致的叉丽蝇、巨尾阿丽蝇和紫绿蝇的基因序列，检索GenBank后亦未发现。

2.2 碱基组成分析

对所得23个样本的28S rRNA基因进行碱基组成分析，结果显示：保守位点678个，可变位点36个，其中简约性信息位点36个，自裔位点0个。碱基平均组成：A=34.1%，G=18.4%，C=13.2%，T=34.2%，A+T=68.3%，具有明显的A+T倾向性。

对所得23个样本的COⅠ基因进行碱基组成分析，结果显示：保守位点523个，可变位点114个，其中简约性信息位点112个，自裔位点2个。碱基平均组成：A=30.6%，G=15.7%，C=15.8%，T=37.8%，A+T=68.4%，具有明显的A+T倾向性。

表1 丽蝇科23个样本28S rRNA基因序列在线BLAST比对结果注：1）本研究提交序列GenBank注册号，其中1～7号样本同文献[2]；2）BLAST比对序列GenBank登录号；“-”表示未发现一致的基因序列编号属种 0丝光绿蝇丝光绿蝇丝光绿蝇大头金蝇大头金蝇大头金蝇铜绿蝇铜绿蝇叉丽蝇叉丽蝇反吐丽蝇反吐丽蝇反吐丽蝇巨尾阿丽蝇巨尾阿丽蝇巨尾阿丽蝇叉叶绿蝇亮绿蝇亮绿蝇亮绿蝇紫绿蝇紫绿蝇紫绿蝇GenBank注册号1）KY KY KY KY KY KY KY MF MF MF MF MF MF MF MF MF MF MF MF MF MF MF MF绿蝇属绿蝇属绿蝇属金蝇属金蝇属金蝇属绿蝇属绿蝇属叉丽蝇属叉丽蝇属丽蝇属丽蝇属丽蝇属阿丽蝇属阿丽蝇属阿丽蝇属绿蝇属绿蝇属绿蝇属绿蝇属绿蝇属绿蝇属绿蝇属BLAST比对结果Lucilia sericataLucilia sericataLucilia sericataChrysomya megacephalaChrysomya megacephalaChrysomya megacephalaLucilia cuprinaLucilia cuprinaTriceratopyga calliphoroides Triceratopyga calliphoroides Calliphora vomitoriaCalliphora vomitoriaCalliphora vomitoriaAldrichina grahamiAldrichina grahamiAldrichina grahamiLucilia caesarLucilia illustrisLucilia illustrisLucilia illustrisLucilia porphyrinaLucilia porphyrinaLucilia porphyrinaGenBank登录号2）JQ.1 JQ.1 JQ.1 JF.1 JF.1 JF.1 FJ.1 JQ.1覆盖率/相似度100%/100%100%/100%100%/100%100%/100%100%/100%100%/100%100%/100%100%/100%----11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 JQ.1 JQ.1 JQ.1 100%/100%100%/100%100%/100%------JQ.1 AJ.1 AJ.1 AJ.1 100%/100%100%/100%100%/100%100%/100%------

文章来源：《洛阳师范学院学报》网址: http://www.lysfxyxb.cn/qikandaodu/2021/0323/540.html